巴贝虫检测 血涂片镜检法
时间: 2018-02-26 浏览次数: 文章录入: 张仪
巴贝虫检测 血涂片镜检法
1 范围
本标准规定了巴贝虫血涂片的制作、固定、染色和显微镜检测
本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的显微镜检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(eqv ISO 3696:1987)
WSXXX-2015 巴贝虫诊断
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1 巴贝虫 Babeisia spp
巴贝虫是一类寄生在人和动物红细胞内的原虫,是巴贝虫病(Babeisiosis)的病原体。感染人的巴贝虫有田鼠巴贝虫(Babesia microti)、分歧巴贝虫(B. divergens)、邓肯巴贝虫(B. duncani)和猎户巴贝虫(B. venatorum)等。
3.2 血涂片 blood films
将血液涂制于载玻片上制成的涂片。供显微镜检查巴贝虫的血涂片包括厚血膜涂片和薄血膜涂片两种。
4 仪器和器材
4.1 光学显微镜(100×油浸物镜、10×目镜)
4.2 载玻片(无划痕无油污的洁净载玻片)
4.3 推片
4.4 血涂片染色架
4.5 血涂片干燥架
4.6 玻片盒
4.7 染色盘和染色缸
5 试剂和材料
所有化学试剂均为分析纯。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。
5.1 吉氏染色原液(Giemsa)(参加附录B)
5.2 pH7.2-pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)(参加附录B)
5.3 甲醇
5.4 香柏油或专用浸油(折射率≥1.5)
5.5 二甲苯
5.6 70%酒精
5.7 一次性采血针
5.8 一次性手套
5.9 一次性吸管
6 检测步骤
6.1 血液涂片的制作
6.1.1 采血部位及取血方法
末梢(无名指指尖或耳垂)取血。用70%酒精棉球消毒取血部位,待酒精干后,用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖,右手持一次性采血针迅速刺入皮肤,不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。婴儿可从拇趾或足跟扎刺取血。
6.1.2 厚血膜制作
取1张载玻片,用1张已消毒推片的一角,取4μL-5μL血量,使血滴与平置的载玻片中央偏右的位置接触,由里向外一个方向旋转,转2圈-4圈,涂成直径0.8cm-1cm大小圆形厚血膜。厚度以1个油镜视野内可见到5个-10个白细胞为宜。
6.1.3 薄血膜制作
用干棉球抹净推片左下角上的血渍,用推片同一端中部刮取1μL-2μL血量。将血置于第一张玻片离厚血膜约0.3cm远的地方,将推片的边缘紧贴载玻片,轻轻上下移动,使血液沿边缘散开,当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时,使2张玻片保持 45°角,从右向左迅速推动推片向前推成舌状薄血膜。每张载玻片上1个厚血膜和1个薄血膜(参见附录D)。
6.1.4 编号
血膜制好后水平放置,充分干燥后,用铅笔在玻片一侧毛玻璃上或在靠近薄血膜一端边上编号。
6.2 固定与溶血
6.2.1薄血膜固定
将薄血膜一端朝下呈45°角,用一次性吸管蘸取甲醇溶液,均匀轻抹于薄血膜表面,避免碰触厚血膜。
6.2.2 厚血膜溶血
在干燥的厚血膜上滴加蒸馏水数滴,完全覆盖血膜,溶血数分钟,待血膜呈浅灰色,倾去溶血液。厚血膜1天内染色无需溶血,超过1天或成批染色的应溶血。
6.3 吉氏染色
6.3.1 吉氏染液的配制(参见附录B)
吉氏染液包括吉氏染液原液和吉氏染液工作液。吉氏染液原液由5g吉氏粉加250 mL甘油充分研磨后加入250 mL甲醇配制。吉氏染液原液在避光条件下可长期保存。常用的吉氏染液工作液包括 2%和 5%浓度两种,分别由吉氏染液原液和pH 7.2-pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)按比例配制。吉氏染液工作液只能使用时新鲜配制。
6.3.2 单张血涂片染色(参见附录C)
单张血涂片吉氏染色常用于临床巴贝虫病患者的显微镜疟原虫检测。采用2%吉氏染液的常规染色方法血涂片染色质量较好,可长期保存,但染色时间较长(≥30min)。采用10%吉氏染液的快速染色方法染色时间较短(约10min-15min),但血涂片不适合长期保存。
6.3.3 成批血涂片染色(参见附录C)
成批血涂片吉氏染色常用于人群流行病学调查中的显微镜巴贝虫检测,常采用2%吉氏染液进行批量血涂片染色。
6.4 镜检
6.4.1 显微镜检查
在染色后的血膜上加1滴香柏油或专用浸油,用100×油浸物镜、10×目镜的光学显微镜检查。染色质量较好的血膜,红细胞呈淡红色,嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红色,嗜中性粒细胞核呈紫蓝色,淋巴细胞胞浆呈蓝色或淡蓝色,巴贝虫呈红紫色,胞浆呈蓝色或淡蓝色。无疟色素。看片路线顺序为薄血膜从舌尖部分开始,厚血膜从上端或下端开始(参见附录D)。
6.4.2 结果判定
6.4.2.1 巴贝虫检测阴性
检查完整个厚血膜或最少检查300个厚血膜油镜视野未查见巴贝虫判为阴性。
6.4.2.2 巴贝虫检测阳性
血膜中查到巴贝虫判定为阳性。感染人体的巴贝虫滋养体在红细胞中呈红紫色、直径约l-3nm的环状体,并有蓝色或浅蓝色的细胞质。环状体可为圆形、卵形、梨形或者变形虫样。有时还可见四联体的裂殖子(又叫马尔他十字)。巴贝虫无疟色素。详见附录A。
6.5 疟原虫的计数
薄血膜的巴贝虫染虫率计数法:镜检薄血膜,计数每个视野中的染虫红细胞和红细胞总数,计数1000个红细胞以上。用下式算出巴贝虫染虫率。染虫红细胞÷红细胞总数×100%=巴贝虫染虫率。如果染虫率很低时,红细胞计数以男性按500万个/μL血、女性按450万个/μL血计算,用整张片子的染虫红细胞÷红细胞总数×100%=巴贝虫染虫率。
6.5 血涂片保存
用吸水纸吸去已检血涂片血膜表面的香柏油,在血膜上滴加2滴-3滴二甲苯,然后用吸水纸吸干(专用浸油无需用二甲苯清洗,可直接用吸水纸吸干)。置血涂片于玻片盒内,避光、干燥和阴凉保存,以备复核。
 
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